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環(huán)形細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)--使細(xì)胞侵襲的過(guò)程可視化

更新時(shí)間:2016-06-03   更新時(shí)間:2016-06-03   點(diǎn)擊次數(shù):2114次

腫瘤細(xì)胞的侵襲能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要特征。為了研究腫瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程的機(jī)制,一系列體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)建立起來(lái),用于研究細(xì)胞侵襲基底膜和基質(zhì)的過(guò)程。體外侵襲實(shí)驗(yàn)首先是采用人工重構(gòu)基底膜材料Matrigel,可以在37℃逐漸凝固成膠,結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。通常的實(shí)驗(yàn)是在孔徑8μm的濾膜上鋪上一層Matrigel,細(xì)胞不能自由穿過(guò),必須分泌水解酶,并通過(guò)變形運(yùn)動(dòng)才能穿過(guò)。實(shí)驗(yàn)之后通過(guò)對(duì)穿過(guò)“基質(zhì)膜”的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),來(lái)確定細(xì)胞的侵襲能力。這一方法非常仿真的模擬了細(xì)胞在生物狀態(tài)下的侵襲過(guò)程,但是其也有一定的局限性。由于濾膜的不透光性,使得直接觀察細(xì)胞偽足和骨架變化變得非常困難。

 

英國(guó)的科研人員改進(jìn)了腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)了一種環(huán)形細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),使得操作進(jìn)一步簡(jiǎn)化,并且也能模擬3D侵襲。重要的是,能夠使侵襲過(guò)程中的活細(xì)胞或者是固定的細(xì)胞可視化。借用這個(gè)實(shí)驗(yàn)方法,研究人員發(fā)現(xiàn)侵襲過(guò)程中主要有蛋白酶參與其中。研究發(fā)現(xiàn),在3D侵襲的細(xì)胞中蛋白酶會(huì)聚集在偽足和細(xì)胞的粘附點(diǎn)上。

 

Cells Assemble Invadopodia-Like Structures and Invade into Matrigel in a Matrix Metalloprotease Dependent Manner in the Circular Invasion Assay

X. Yu and L. M. Machesky

PLoS ONE, 2012, 10.1371/journal.pone.0030605

 

 

(一)實(shí)驗(yàn)材料

  • 細(xì)胞:   MDA-MB-231
  • 實(shí)驗(yàn)耗材:  傷口愈合插件         (ibidi,80209)

               玻璃底培養(yǎng)皿      (ibidi,81158) 

  • 試劑:    Matrigel           (BD)

             4%多聚甲醛溶液

             0.1%Triton X-100

 

(二)實(shí)驗(yàn)步驟

  • 將ibidi傷口愈合插件放入ibidi玻璃底培養(yǎng)皿中間
  • 在插件外部鋪 6 × 105 MDA-MB-231細(xì)胞,等待細(xì)胞貼壁
  • 細(xì)胞貼壁后移除傷口愈合插件,在細(xì)胞形成一個(gè)0.8cm2的空白區(qū)域
  • 加入250μl50% BD Matrigel (4.5mg/ml),將培養(yǎng)皿內(nèi)層剛好鋪滿,能形成一個(gè)0.8mm厚度的“基質(zhì)膜”
  • 孵育2小時(shí),使Matrigel固化,加入培養(yǎng)基
  • 在37。C培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
  • 4%多聚甲醛溶液固定30分鐘,并以 0.1%Triton X-100通透30分鐘后可以加入DAPI或者抗體染色

 

 

  • 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 

 

1、使用環(huán)形細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴^測(cè)到細(xì)胞侵襲中的活動(dòng)(圖一)

 

 

 

圖一:MDA-MB-231細(xì)胞在環(huán)形細(xì)胞侵襲過(guò)程中形成了侵襲鏈:A)MDA-MB-231細(xì)胞在matrigel中形成了一個(gè)長(zhǎng)的侵襲鏈 B)勤洗臉的免疫熒光圖,紅色為Actin,藍(lán)色為細(xì)胞核

 

 

2. 使用環(huán)形侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴涗泴?duì)比侵襲速率和侵襲面積(圖二)

 

 

 

圖二:MDA-MB-231細(xì)胞侵襲過(guò)程受MMP調(diào)控。加入25μM的GM6001能顯著的減緩侵襲速率和侵襲面積。

聯(lián)


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